さて、今日の問題は「大腸菌における組換えタンパク技術」において、昨日の「２種の抗生物質選択」と並ぶ「Blue White Selection」という代表技術です。抗生物質は２種でなく１種のみ近い、別のもので選別します。
★2013年麻布大獣医学部問題（一部改）
糖尿病の治療に使用されるinsulin製剤は、ヒトinsulin遺伝子を導入した組み換え
大腸菌により生産されている。ヒトinsulinタンパク質を生産する組換え大腸菌を
得るために次の手順で実験を行った。
●ampRは抗生物質抵抗性遺伝子
●X-galを加えると分解し、青色色素を作る酵素を作る遺伝子
実験１ 図に示した大腸菌内で増殖するplasmidを
赤→の位置で制限酵素により切断した。
実験２ ヒトのgenomeDNAから制限酵素で切断して得た
insulin遺伝子（I遺伝子）と
ヒトのすい臓細胞に含まれる
insulin遺伝子のmRNAから人工的に合成した
DNA（Ⅱ遺伝子）を、それぞれ実験１で切断された
plasmidと結合させた。
実験３ 作製した２種類のplasmidをそれぞれ大腸菌
に取り込ませた。
実験４ 作製した組み換え大腸菌の中から目的のplasmidを持った大腸菌を選別した。
★問１ DNA断片と切断したplasmidを結合させるために用いた酵素はどれか？
①DNA ligase ②DNA polymerase ③DNA helicase ④逆転写酵素 ⑤制限酵素
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①
★問２ 作製した組み換え大腸菌の中から、plasmidを持つものだけを選別することができる
寒天培地として適切なものを選べ。
①十分な栄養分が含まれる寒天培地
②特定の栄養素が欠如した寒天培地
③ampicillinが含まれる寒天培地
④ampicillinとX-galが含まれる寒天培地
⑤X-galが含まれる寒天培地
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答③
解説
plasmidが戻っていれば、ampicilinに対する抵抗性は共通にあるので、
plasmidが戻った大腸菌だけを選ぶならばampicilin培地で育ったものを選べばよい。
★問３ 作製した組み換え大腸菌の中から目的のDNAが組み込まれたplasmidを持つもの
だけを選別することができる寒天培地をはどれか？
①十分な栄養分が含まれる寒天培地
②特定の栄養素が欠如した寒天培地
③ampicillinが含まれる寒天培地
④ampicillinとX-galが含まれる寒天培地
⑤X-galが含まれる寒天培地
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答
④
解説 昨日のkanR遺伝子部位と同様、目的DNAが組み込まれたか否かを
lacZの発現の有無で選別できるので「ampicilin＋Xgal」が必要。
★問４「ampicilin＋Xgal」培地で育てると、下図のようにblueとwhiteのコロニーができた。どちらが遺伝子が組み込まれた大腸菌か？
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答
White
解説
青が発色できるということは、lacZ遺伝子が破壊されていないのであるから「赤→」の部分に目的遺伝子が組み込まれていない。
白いコロニーのほうが、l赤→」の部分に目的遺伝子が組み込まれ、
遺伝子導入が成功したコロニーである。
一見、発色したほうが派手なので成功に見えるが、発色しないほうが成功であるので注意！
問５ 実験４で得られたⅠ遺伝子とⅡ遺伝子が組み込まれた大腸菌のうち、正しく機能する
insulinが合成されるのはどちらか一方のみである。その理由として適切なものを選べ。
①Ⅰが組み込まれた大腸菌は遺伝子の一部をintronとして除去してしまうため。
②Ⅰが組み込まれた大腸菌はsplicingを行えないため。
③Ⅱが組み込まれた大腸菌はintronが除去されており、原核生物のribosome
では正しくタンパク質合成ができないため。
④Ⅱが組み込まれた大腸菌の遺伝子はRNA polymeraseに認識されずmRNAが合成されない。
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②
解説
ヒト遺伝子そのものを大腸菌に読ませるとsplicingを行えないので、intronまで読んでしまい、正しいinsulinが合成できない。